Фотометрия

Ослабление — интенсивность — световой поток

Ослабление интенсивности светового потока при прохождении через раствор, очевидно, зависит от количества поглощающих свет центров, встречающихся на пути светового потока.
 

Ослабление интенсивности светового потока при прохождении через раствор, газ или твердое тело, очевидно, зависит от количества поглощающих свет центров, встречающихся на пути потока излучения.
 

Ослабление интенсивности светового потока при прохождении через раствор, очевидно, зависит от количества поглощающих свет центров на пути светового потока. Рассмотрим поглощение света раствором окрашенного соединения при условии, что состав и структура этого соединения не меняется с изменением его концентрации. Примером такого раствора может быть хромат калия; для постоянства рН при разбавлении к раствору прибавляют тетрабо — — рат натрия.
 

С чем связано ослабление интенсивности светового потока.
 

Турбидиметрия основана на измерении ослабления интенсивности светового потока I, прошедшего через пробу.
 

Знак минус говорит об ослаблении интенсивности светового потока.
 

Турбидиметрический метод основан на измерении ослабления интенсивности светового потока, прошедшего через суспендированный раствор. По технике выполнения турбидиметрическое определение не отличается от колориметрического. Степень помутнения раствора можно измерить визуально путем сравнения со стандартной шкалой. При освещении раствора со суспендированными частицами лампой дневного света чувствительность значительно повышается.
 

При всех методах колориметрического анализа определяется ослабление интенсивности светового потока после прохождения его через окрашенный раствор. Принято сравнивать интенсивность светового потока, проходящего через испытуемый раствор, с интенсивностью потока, проходящего через стандартный раствор известной концентрации. Такое сравнение производится аналитиком либо глазом — визуальный метод, или с помощью фотоэлементов-приборов, в которых под влиянием света возникает электрический ток; сила тока зависит от интенсивности светового потока.
 

В основе любого метода измерения интенсивности окраски лежит определение ослабления интенсивности светового потока ( лучше — при определенной длине волны) после прохождения через испытуемый раствор. Для этого обычно сравнивают два световых потока: один, проходящий через испытуемый раствор, а другой через определенный стандартный раствор или, по крайней мере, через растворитель.
 

Турбидиметрическим называют метод оптического анализа, основанный на измерении ослабления интенсивности светового потока, прошедшего через суспензию, вследствие поглощения и рассеивания светового потока суспензией.
 

В основе любого метода измерения оптической плотности раствора лежит определение ослабления интенсивности светового потока ( лучше-при определенной длине волны) после прохождения через испытуемый раствор. Для этого обычно сравнивают два световых потока: один, проходящий через испытуемый раствор, а другой, проходящий через определенный стандартный раствор или, по крайней мере, через растворитель.
 

Щелевая диафрагма Дд, расположенная в левом световом пучке, служит для ослабления интенсивности левого светового потока, падающего на тот же фотоэлемент.
 

Турбидиметрическим методом анализа ( турбидиметрией) называют метод, основанный на измерении ослабления интенсивности светового потока, прошедшего через раствор, содержащий твердые частицы, вследствие поглощения и рассеяния светового потока.
 

Теоретические основы определения оптической плотности раствора

Любая частица, будь то молекула, атом или ион, в результате поглощения кванта света переходит на более высокий уровень энергетического состояния. Чаще всего осуществляется переход из основного в возбужденное состояние. Это вызывает появление в спектрах определенных полос поглощения.

Поглощение излучения приводит к тому, что при пропускании его через вещество интенсивность этого излучения снижается при увеличении количества частиц вещества, обладающего некоторой оптической плотностью. Этот метод исследования предложил В. М. Севергин еще в 1795 году.

Наилучшим образом этот метод годится для реакций, где определяемое вещество способно переходить в окрашенное соединение, что вызывает изменение окраски исследуемого раствора. Измерив его светопоглощение или сравнив окраску с раствором известной концентрации, несложно найти процент содержания вещества в растворе.

Проведение калибровки

Как уже было сказано выше оптическая плотность и концентрация определяемого вещества связаны линейной зависимостью.

Отсюда следует, что, зная уравнение прямой для данной зависимости мы можем по любой известной оптической плотности узнать концентрацию интересующего нас вещества.

Для того, чтобы узнать это уравнения проводится процедура калибровки.

На практике если калибровка делается вручную процедура заключается в построении так называемой калибровочной кривой (которая в случае фотометрического измерения чаще всего является прямой линией :).

Для построения линейной зависимости требуется как минимум две точки.

Для начала берется раствор с известной концентрацией вещества (калибратор), которое мы собираемся измерять. После проведения соответствующей химической реакции измеряется оптическая плотность получившейся реакционной смеси, при этом на графике по оси абсцисс откладывается концентрация вещества в растворе, а по оси ординат получившаяся оптическая плотность. Таким образом мы получаем первую точку на графике. Для получения второй точки можно использовать раствор с другой концентрацией, но на практике исходят из предположения, что раствор с нулевой концентрацией обладает нулевой оптической плотностью и в качестве второй точки просто берется начало координат (на самом деле это не так, но это преодолевается при помощи специальных процедур настройки прибора), что позволяет проводить калибровку большинства показателей биохимии по калибратору только с одним уровнем концентрации.

Таким образом получается график, используя который, можно по известной оптической плотности определить концентрацию вещества в растворе.

Калибровочный график

В современный лабораториях калибровку как правило вручную не проводят, это делается автоматически биохимическими анализаторами или другими приборами с фотометрической детекцией на борту.

Суть остается той же за исключением того, что прибор делает расчет для нахождения функции, описывающей калибровочный график, и далее использует ее для расчета концентраций. Калибровочный график при этом строится исключительно для удобства пользователя.

В общем виде функция, описывающая прямую линию, выглядит следующим образом:

y=ax+b

Где:

• y — оптическая плотность
• x — концентрация исследуемого вещества
• a — тангенс угла наклона нашей прямой (фактор калибровки)
• b — оптическая плотность при нулевой концентрации, как правило равна нулю

Поскольку значение b при помощи настроек прибора приводится к значению ноль, то вся процедура калибровки сводится к нахождению фактора калибровки, при умножении на него оптической плотности анализатор в дальнейшем вычисляет все концентрации интересующего нас вещества.

Расчет концентрации светопоглощающих растворов

При работе с приборами, позволяющими непосредственно измерять оптическую плотность D, для расчета концентрации испытуемых растворов можно применять следующие методы.

1. Графический метод, основанный на построении калибровочного графика в координатах оптическая плотность — концентрация.

Для построения калибровочного графика измеряют поглощение серии окрашенных растворов известной, но различной концентрации, оптические плотности которых охватывают требуемый интервал. С этой целью применяют стандартный раствор определяемого вещества. Тщательно отмеряют пипеткой определенные части этого раствора, добавляют к ним соответствующий реагент и соблюдают условия максимального развития окраски (время выдержки, температура). После этого каждый раствор разбавляют в мерной колбе до определенного объема и измеряют поглощение при выбранной длине волны. График зависимости поглощения света от концентрации поглощающего вещества обычно представляет собой прямую линию, тангенс угла наклона которой равен коэффициенту пропускания Т или молярному коэффициенту поглощения E с лямбдой. При построении калибровочного графика результаты измерений вначале наносят в виде 5-8 точек, различающихся по концентрации не менее чем на 30%, а затем проводят прямую линию либо через эти точки, либо как можно ближе к ним. Это ведет к усреднению и уменьшению ошибок, вызванных неточностями приготовления и измерения поглощения стандартных растворов. Фотометрическую реакцию анализируемого образца проводят в тех же условиях, что и для стандартных растворов. Измерив поглощение раствора образца, можно по калибровочному графику определить его концентрацию.

2. Если заранее известно, что испытуемые растворы подчиняются законам поглощения излучений, то приготовляют два раствора — эталонный, концентрация которого Сэ известна, и испытуемый (его концентрация Сх) и определяют их оптические плотности Dэ и Dx. Концентрацию испытуемого раствора вычисляют по формуле:

3. Если заранее известно значение молярного коэффициента поглощения при данной длине волны монохроматического света E с лямбдой, то, зная толщину поглощающего слоя (толщину слоя кюветы), концентрацию испытуемого раствора вычисляют по формуле:

Многокомпонентный спектрофотометрический анализ

Многокомпонентный спектрофотометрический анализ (анализ смесей) применяют для одновременного количественного определения нескольких компонентов лекарственных средств, каждое из которых подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера.

Количественное определение в многокомпонентном спектрофотометрическом анализе основывается обычно на использовании уравнения:

где:

А_i – оптическая плотность испытуемого раствора при i-ой длине волны;

Е_ij – показатели поглощения (зависящие от способа выражения концентрации) j-го компонента образца при i-ой аналитической длине волны;

c_j – концентрация j-го компонента образца.

Соответствующие методики проведения анализа и расчетные формулы указываются в фармакопейных статьях.

Выбор длинны волны

При проведении фотометрического измерения источник света как правило генерирует световой поток по всему видимому (и не только) спектру длин волн. Источники света современных биохимических анализаторов как правило охватывают диапазон от ближнего ультрафиолета и до всего видимого красного диапазона.

Как уже говорилось ранее молярный коэффициент поглощения является функцией от длинны волны и следовательно исследуемый раствор будет обладать разными коэффициентами поглощения на разных длинах волн. При этом на практике, в основном для того, чтобы избежать влияния неспецифических факторов, измерения проводится на какой-то одной определенной длине волны.

Для выбора длины волны на заре лабораторной диагностики существовало такое наивное эмпирическое правило: если мы видим, что раствор окрашен в какой-либо цвет, то нужно выбрать для измерения длину волны по цвету, отличающуюся от цвета раствора.

Помимо того, что данный подход слишком упрощен, он еще и не применим к ультрафиолетовой части спектра.

Более научный подход заключается в построении графика зависимости оптической плотности раствора от длинны волны.

Поскольку измеряемые биохимическими методами биологические вещества, как правило не обладают достаточной собственной оптической плотностью, для их детекции используются различные специфические химические реакции, которые в итоге и генерируют вещества обладающие достаточной оптической плотностью, в этом случае говорят, что реакция идет с увеличением оптической плотности. Либо в процессе реакции такие вещества расходуются, тогда реакция идет с уменьшением оптической плотности.

Для выбора длинны волны для конкретного метода проводится построение двух графиков зависимости оптической плотности раствора от длинны волны:

• для субстрата (субстратов) химической реакции
• и для продуктов (продукта) химической реакции

После построения графика берется длинна волны, на которой разность оптической плотности у субстратов и продуктов реакции максимальна.

Для примера можно взять так называемый оптический тест Варбурга.

Данная реакция заключается в обратимом окислении никотинамидадениндинуклеотида (НАД) под действием какого-нибудь фермента из класса оксидоредуктаз.

В результате мы имеем два графика для окисленной и восстановленной формы НАД одна из которых играет роль субстрата, а другая продукта реакции в конкретных биохимических наборах.

Оптический тест Варбурга

В результате анализа данного графика видим, что наибольшая разница оптической плотности между этими двумя формами находится в районе 340 нм. Именно эта длинна волны и используется для определения перечисленных выше биохимических показателей.

Устройство, которое преобразует свет от источника в световой поток с какой-то одной определенной длинной волны называется монохроматор.

Основные типы монохроматоров:

• Абсорбционный светофильтр — самый первый монохроматор, по большому счету представляющий из себя просто цветное стеклышко
• Дифракционный светофильтр
• Призма
• Дифракционная решетка — в настоящее время у большинства лучших биохимических анализаторов монохроматор представляет из себя голографическую дифракционную решетку

Таким образом, если включить в нашу схему простейшего фотометра монохроматор (например призму), то она будет выглядеть следующим образом.

Фотометрия на определенной длинне волны