Фотометрия в лабораторной диагностике

Что такое оптическая плотность и зачем ее рассчитывать

Расчет оптической плотности важен во многих областях науки и техники. Например, в биологии ее используют для измерения концентрации белка или ДНК в биологических образцах. В химии оптическая плотность позволяет определить концентрацию вещества в растворе и следить за процессами химических превращений. В медицине оптическая плотность используется для диагностики и контроля хода лечения ряда заболеваний.

Расчет оптической плотности производится путем измерения пропускания света через раствор при различных длинах волн и составлении спектральных графиков. Далее, по этим данным, можно рассчитать оптическую плотность по формуле и сравнить полученные результаты с эталонными значениями или с другими измерениями для определения концентрации вещества в растворе. Расчет оптической плотности является неотъемлемой частью спектрофотометрии и позволяет получить точные и надежные данные о концентрации и поглощении вещества в растворе.

Длина волны (нм)	Коэффициент пропускания (T)	Оптическая плотность (OD)
400	0.8	0.1
450	0.6	0.22
500	0.4	0.4

Приведенная таблица является примером расчета оптической плотности. В ней представлены значения пропускания света через раствор при различных длинах волн, а также соответствующие оптические плотности. Эти данные могут быть использованы для определения концентрации вещества в растворе и получения более полной информации о свойствах рассматриваемого вещества.

Закон Бугера-Ламберта-Бера

Он является математическим выражением, отображающим зависимость уменьшения интенсивности монохроматического потока света от концентрации светопоглощающего вещества и толщины жидкостного слоя, через который он пропущен:

I = I 0 * 10 -ε·С·ι , где:

• ε — коэффициент поглощения света;
• С — концентрация вещества, моль/л;
• ι —толщина слоя анализируемого раствора, см.

Преобразовав, эту формулу можно записать: I / I 0 = 10 -ε·С·ι .

Суть закона сводится к следующему: различные растворы одного и того же соединения при равной концентрации и толщине слоя в кювете поглощают одинаковую часть падающего на них света.

Прологарифмировав последнее уравнение, можно получить формулу: D = ε * С * ι.

Очевидно, что оптическая плотность напрямую зависит от концентрированности раствора и толщины его слоя. Становится ясен физический смысл молярного коэффициента поглощения. Он равен D для одномолярного раствора и при толщине слоя в 1 см.

Производная спектрофотометрия

В производной спектрофотометрии исходные спектры поглощения (нулевого порядка) преобразуются в спектры производных первого, второго и более высокого порядков.

Спектр первой производной представляет собой график зависимости градиента кривой поглощения (скорость изменения оптической плотности от длины волны, dA/dλ) от длины волны.

Спектр второй производной представляет собой график зависимости кривизны спектра поглощения (d2A/dλ2) от длины волны. Вторая производная при любой длине волны связана с концентрацией следующим соотношением:

где:

А– оптическая плотность при длине волны λ;

– удельный показатель поглощения при длине волны λ;

с– концентрация вещества в растворе, в граммах/100 мл;

l– толщина слоя, в сантиметрах.

Производная спектрофотометрия может быть использована как для целей идентификации веществ, так и для их количественного определения в многокомпонентных смесях, а также в тех случаях, когда имеется фоновое поглощение, вызванное присутствием веществ, содержание которых не регламентируется.

Приборы

Используют спектрофотометры, отвечающие указанным выше требованиям и оснащенные аналоговым резистивно-емкостным дифференцирующим модулем или цифровым дифференциатором, или другими средствами получения производных спектров, в соответствии с инструкцией к прибору. Некоторые методы получения спектров второй производной приводят к смещению длин волн относительно исходного спектра, что следует учитывать там, где это необходимо.

Разрешающая  способность

Если указано в фармакопейных статьях, записывают спектр второй производной для раствора 0,2 г/л толуола в метаноле, используя метанол в качестве раствора сравнения. На спектре должен присутствовать небольшой отрицательный экстремум, расположенный между двумя большими отрицательными экстремумами при 261 нм и 268 нм, в соответствии с рис. 1. Если нет других указаний в фармакопейных статьях, отношение А/B должно быть не менее 0,2.

Методика

Процедура анализа аналогична применяемой в обычной спектрофотометрии, но вместо оптических плотностей используют производные. Готовят раствор испытуемого образца, настраивают прибор в соответствии с инструкцией производителя и рассчитывают количество определяемого вещества, как указано в фармакопейной статье.

Рисунок 1 – Спектр второй производной раствора толуола (0,2 г/л) в метаноле

Скачать в PDF ОФС.1.2.1.1.0003.15 Спектрофотометрия в УФ и видимой областях

Спектрофотометрия

Спектрофотометрия — метод измерения плотности оптической плотности раствора. При помощи данного метода определяется, как изменяется интенсивность прохождения света через раствор в зависимости от его концентрации. Спектрофотометр используется для измерения различных характеристик раствора на основе абсорбции света.

Измерение плотности оптической плотности производится с помощью спектрофотометра, который обеспечивает точные и повторяемые результаты. Устройство спектрофотометра основано на законе Бугера-Ламберта, согласно которому интенсивность падающего на вещество света экспоненциально убывает с увеличением пути его проникновения в среду. Чем плотнее раствор, тем больше света поглощается, и тем меньше интенсивность излучения, прошедшего через раствор.

С помощью спектрофотометрии можно измерять плотность оптической плотности раствора в разных диапазонах длин волн, что позволяет проводить спектральный анализ вещества. Для этого спектрофотометры используют оптические фильтры или дисперсионные элементы, такие как просвечивающие призмы или решетки, чтобы разделить свет на разные длины волн и измерить его интенсивность на каждой длине волны.

Измерение оптической плотности раствора с помощью спектрофотометрии является важным и удобным методом в аналитической химии, медицине, биологии и других научных областях. Оно позволяет получать количественную информацию о содержании вещества в растворе и определять его свойства на основе взаимодействия со светом.

Описание метода

Оптическая плотность раствора измеряется с использованием специальных приборов, называемых спектрофотометрами. Эти приборы позволяют измерять пропускание света через растворы различной концентрации и определять их оптическую плотность.

Для измерения оптической плотности раствора, сначала необходимо подготовить раствор с известной концентрацией вещества. Затем этот раствор помещается в спектрофотометр, который излучает свет определенной длины волны и измеряет количество света, прошедшего через раствор.

Спектрофотометры обычно используются с двумя кюветами, в которых помещаются растворы для измерения. Одна кювета содержит раствор с известной концентрацией, который служит для калибровки прибора. Вторая кювета содержит раствор с неизвестной концентрацией, оптическую плотность которого необходимо измерить.

Прибор измеряет оптическую плотность раствора путем сравнения пропускания света через обе кюветы. Измеренное пропускание света преобразуется в единицы оптической плотности, такие как абсорбция или оптическая плотность, которые могут использоваться для определения концентрации вещества в растворе.

Измерение оптической плотности раствора имеет широкий спектр применений, включая анализ химических реакций, определение концентрации вещества в растворе, определение молекулярной массы и другие.

Преимущества и ограничения

Оптическая плотность раствора является важной характеристикой, позволяющей определить концентрацию вещества в растворе. Ее измерение осуществляется с помощью специального прибора — спектрофотометра, который позволяет измерить поглощение света в растворе

Преимущества измерения оптической плотности:

• Простота и удобство измерения: для определения оптической плотности не требуется сложной подготовки образца, а также проведения химических реакций.
• Высокая точность: результаты измерений оптической плотности обладают высокой точностью, что позволяет получить достоверную информацию о концентрации вещества в растворе.
• Быстрота измерения: с помощью спектрофотометра можно получить результаты измерений оптической плотности в течение нескольких секунд.

Ограничения измерения оптической плотности:

• Ограниченный диапазон измерений: каждый спектрофотометр имеет свой диапазон измерений, поэтому при измерении оптической плотности необходимо учитывать его ограничения.
• Влияние других параметров: помимо концентрации вещества, оптическая плотность раствора может зависеть от других факторов, таких как температура, давление и pH-значение раствора. Эти параметры могут оказывать влияние на поглощение света и, соответственно, на измерение оптической плотности.
• Необходимость калибровки: перед проведением измерений необходимо провести калибровку спектрофотометра, чтобы установить связь между измеренными значениями оптической плотности и концентрацией вещества в растворе.

В целом, измерение оптической плотности раствора является эффективным методом определения концентрации вещества. Однако для достоверных результатов необходимо учитывать ограничения и проводить измерения с соблюдением требуемых условий.

Выбор длинны волны

При проведении фотометрического измерения источник света как правило генерирует световой поток по всему видимому (и не только) спектру длин волн. Источники света современных биохимических анализаторов как правило охватывают диапазон от ближнего ультрафиолета и до всего видимого красного диапазона.

Как уже говорилось ранее молярный коэффициент поглощения является функцией от длинны волны и следовательно исследуемый раствор будет обладать разными коэффициентами поглощения на разных длинах волн. При этом на практике, в основном для того, чтобы избежать влияния неспецифических факторов, измерения проводится на какой-то одной определенной длине волны.

Для выбора длины волны на заре лабораторной диагностики существовало такое наивное эмпирическое правило: если мы видим, что раствор окрашен в какой-либо цвет, то нужно выбрать для измерения длину волны по цвету, отличающуюся от цвета раствора.

Помимо того, что данный подход слишком упрощен, он еще и не применим к ультрафиолетовой части спектра.

Более научный подход заключается в построении графика зависимости оптической плотности раствора от длинны волны.

Поскольку измеряемые биохимическими методами биологические вещества, как правило не обладают достаточной собственной оптической плотностью, для их детекции используются различные специфические химические реакции, которые в итоге и генерируют вещества обладающие достаточной оптической плотностью, в этом случае говорят, что реакция идет с увеличением оптической плотности. Либо в процессе реакции такие вещества расходуются, тогда реакция идет с уменьшением оптической плотности.

Для выбора длинны волны для конкретного метода проводится построение двух графиков зависимости оптической плотности раствора от длинны волны:

• для субстрата (субстратов) химической реакции
• и для продуктов (продукта) химической реакции

После построения графика берется длинна волны, на которой разность оптической плотности у субстратов и продуктов реакции максимальна.

Для примера можно взять так называемый оптический тест Варбурга.

Данная реакция заключается в обратимом окислении никотинамидадениндинуклеотида (НАД) под действием какого-нибудь фермента из класса оксидоредуктаз.

В результате мы имеем два графика для окисленной и восстановленной формы НАД одна из которых играет роль субстрата, а другая продукта реакции в конкретных биохимических наборах.

Оптический тест Варбурга

В результате анализа данного графика видим, что наибольшая разница оптической плотности между этими двумя формами находится в районе 340 нм. Именно эта длинна волны и используется для определения перечисленных выше биохимических показателей.

Устройство, которое преобразует свет от источника в световой поток с какой-то одной определенной длинной волны называется монохроматор.

Основные типы монохроматоров:

• Абсорбционный светофильтр — самый первый монохроматор, по большому счету представляющий из себя просто цветное стеклышко
• Дифракционный светофильтр
• Призма
• Дифракционная решетка — в настоящее время у большинства лучших биохимических анализаторов монохроматор представляет из себя голографическую дифракционную решетку

Таким образом, если включить в нашу схему простейшего фотометра монохроматор (например призму), то она будет выглядеть следующим образом.

Фотометрия на определенной длинне волны

Многокомпонентный спектрофотометрический анализ

Многокомпонентный спектрофотометрический анализ (анализ смесей) применяют для одновременного количественного определения нескольких компонентов лекарственных средств, каждое из которых подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера.

Количественное определение в многокомпонентном спектрофотометрическом анализе основывается обычно на использовании уравнения:

где:

А_i – оптическая плотность испытуемого раствора при i-ой длине волны;

Е_ij – показатели поглощения (зависящие от способа выражения концентрации) j-го компонента образца при i-ой аналитической длине волны;

c_j – концентрация j-го компонента образца.

Соответствующие методики проведения анализа и расчетные формулы указываются в фармакопейных статьях.

Абсорбция

Абсорбция – это процесс поглощения оптической энергии веществом. Она характеризуется оптической плотностью раствора и является важным физическим понятием в оптике и спектроскопии.

Оптическая плотность раствора описывает способность вещества поглощать свет. Она измеряется величиной, называемой коэффициентом поглощения (α) и выражается в см^-1. Чем выше значение коэффициента поглощения, тем больше света раствор способен поглотить.

Величина оптической плотности раствора зависит от концентрации и свойств вещества, растворенного в растворе, а также от длины волны света. Часто оптическую плотность измеряют при помощи спектрофотометра, который определяет изменение интенсивности света после прохождения через раствор.

Значение оптической плотности раствора может быть использовано для определения концентрации вещества в растворе или для исследования его оптических свойств. Такие исследования играют важную роль в различных науках и индустрии, включая химию, медицину, физику и материаловедение.

Описание и формула

Оптическая плотность раствора — это физическая величина, характеризующая меру поглощения светового излучения раствором. Измеряется она в специальных единицах — оптических плотностях (ОП).

Для измерения оптической плотности раствора используются специальные приборы, называемые спектрофотометрами. С помощью спектрофотометра измеряется поглощение света раствором в различных длинах волн. Полученные данные можно представить в виде графика поглощения в зависимости от длины волны.

Оптическая плотность раствора определяется по формуле:

ОП(λ)	=	log10(I/I)

где:

• ОП(λ) — оптическая плотность раствора при определенной длине волны λ;
• I — интенсивность падающего света;
• I — интенсивность прошедшего света.

Величина ОП(λ) позволяет определить степень поглощения света раствором при конкретной длине волны. Чем больше значение оптической плотности, тем больше свет поглощается раствором.

Преобразование абсорбции в оптическую плотность

Оптическая плотность раствора измеряется с использованием спектрофотометра, который позволяет измерить количество света, поглощенного раствором при определенной длине волны.

Абсорбция, или поглощение света, может быть измерена в спектрофотометре посредством сравнения интенсивности падающего света до и после прохождения через раствор. Чем больше света поглощается раствором, тем выше его абсорбция.

Оптическая плотность раствора представляет собой меру концентрации поглощающего вещества в растворе и рассчитывается с использованием закона Бугера. Закон Бугера устанавливает линейную зависимость между абсорбцией (A) и концентрацией поглощающего вещества (c), а также относит показатели абсорбции и оптической плотности на единичное значение пути света (l).

1. Оптическая плотность (ОП) раствора может быть рассчитана по формуле: ОП = A / l
2. Величина оптической плотности может использоваться для определения концентрации вещества в растворе, используя формулу: c = A / (l * е), где е — коэффициент поглощения.

Преобразование абсорбции в оптическую плотность позволяет получить количественные данные о концентрации поглощающего вещества в растворе и является важным шагом в многих аналитических методах, таких как спектрофотометрия и химический анализ.

Многокомпонентный спектрофотометрический анализ

Многокомпонентный спектрофотометрический анализ (анализ смесей) применяют для одновременного количественного определения нескольких компонентов лекарственных средств, каждое из которых подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера.

Количественное определение в многокомпонентном спектрофотометрическом анализе основывается обычно на использовании уравнения:

А_i – оптическая плотность испытуемого раствора при i-ой длине волны;

Е_ij – показатели поглощения (зависящие от способа выражения концентрации) j-го компонента образца при i-ой аналитической длине волны;

c_j – концентрация j-го компонента образца.

Соответствующие методики проведения анализа и расчетные формулы указываются в фармакопейных статьях.

Спектрофотометрические методы анализа

Спектрофотометрия широко применяется для установления связи между спектрами поглощения различных веществ и их химическим строением и составом, а также для количественного определения веществ.

Абсорбционная спектрометрия основана на тех же законах светопоглощения, что и фотоколориметрические методы, однако, в отличие от последних, в ней используется поглощение монохроматического света с очень узким интервалом длин волн (1-2 нм). Это значительно увеличивает чувствительность и точность количественного анализа окрашенных растворов, поглощающих свет в видимой области спектра, а также «бесцветных» для глаза растворов, которые поглощают излучение в ультрафиолетовой (200-400 нм) или ближней инфракрасной области спектра.

Спектрофотометры подразделяются на регистрирующие и нерегистрирующие. В регистрирующих приборах результаты всех измерений автоматически записываются на специальном бланке, имеющем вид сетки.

Нерегистрирующие спектрофотометры обычно включают источник излучения, монохроматор, приемник излучения и отсчетное устройство. Количественные измерения пропускания производятся сравнением сигналов приемника при попеременной установке в световой пучок образца и эталона. При измерениях поглощения светового потока жидкостями обычно пользуются двумя идентичными кюветами, одна из которых заполняется исследуемым раствором, а другая (пустая или наполненная растворителем) играет роль эталона, пропускание которого принимают за 100%, а оптическую плотность считают равной нулю.

К нерегистрирующим спектрофотометрам с кварцевой оптикой относятся модели СФ-4, СФ-4А, СФ-16, обеспечивающие возможность производить измерения, помимо видимой и ближней инфракрасной, также в ультрафиолетовой области спектра.

К нерегистрирующим спектрографам со стеклянной оптикой относится модель СФ-5, используемая для измерений только в видимой и ближней инфракрасной области спектра.

Нерегистрирующие спектрофотометры имеют одинаковую оптическую схему, но несколько различаются электрическими схемами и методикой измерений.

Принципиальная оптическая схема спектрофотометра СФ-16, с пределами измерения оптических плотностей 0-2 и пропускания 100-0, 10-0, 100-90% представлена на рис. 186. Свет от источника 1 попадает на зеркало-конденсор 2, которое направляет пучок лучей на плоское зеркало 3, поворачивающее лучи на 90° и направляющее их на входную щель монохроматора 4. Зеркальный объектив 6 направляет параллельный пучок лучей на призму 5, которая разлагает его в спектр и возвращает его обратно на объектив 6. Луч, прошедший призму под углом близким к углу наименьшего отклонения, попадает на выходную щель 7, расположенную под входной. Поворачивая призму вокруг оси, можно получить на выходе монохроматора лучи различных длин волн. Выходящий из монохроматора пучок света проходит фильтр 8, кювету с исследуемым раствором 9 и попадает на фотоэлемент 10. Фототок, возникающий в фотоэлементе, передается на усилитель постоянного тока. Усиленный ток попадает на милливольтметр.

Спектрофотометр СФ-16 относится к однолучевым приборам, поэтому в процессе измерений на пути потока излучения устанавливаются поочередно «нулевой» и испытуемый образцы. Происходящие при этом изменения интенсивности излучения, падающего на фотоэлемент, вызывают изменение напряжения в системе усилителя, которое компенсируется путем изменения напряжения на потенциометре, связанном с отсчетным устройством.

Включение прибора в сеть производится согласно прилагаемой к нему инструкции, в которой также даются указания относительно техники работы с ним.

Идентификация

Абсорбционную спектрофотометрию в ультрафиолетовой и видимой областях спектра применяют для определения подлинности лекарственных средств путем:

– сравнения спектров поглощения испытуемого раствора и раствора стандартного образца; в указанной области спектра должно наблюдаться совпадение положений максимумов, минимумов, плеч и точек перегиба;

– указания положений максимумов, минимумов, плеч и точек перегиба спектра поглощения испытуемого раствора; расхождение между наблюдаемыми и указанными длинами волн в максимумах и минимумах поглощения не должно обычно превышать ± 2 нм.

Возможны и другие варианты применения, оговоренные в фармакопейных статьях.

Прибор предназначен для измерения оптиче¬ской плотности растворов пределах от 0 до 1,3; большие оптические плотности измеряются менее точно.

Принцип работы фотоэлектроколориметров состоит в сравнении интенсивности потоков света, прошедшего через раствори¬тель (I0) и через исследуемый раствор (I). Внешний вид и оптическая схема ФЭК-56М представлена на рис. 4 и 5.

Рис. 4. Внешний вид фотоэлектроколориметра ФЭК-56М: 1 – источник света (лампа накаливания); 2 – шторка; 3 – кюветное от-деление ; 4 – барабан светофильтров; 5, 6 – левый и правый барабаны; 7 – микроамперметр; 8 , 9 – шкалы для считывания показаний.

Для измерения светопоглощения выбирают спектральную область, в которой чувствительность анализа наиболее высокая. Фо-тоэлектроколориметр ФЭК-56М снабжен кассетой с девятью светофильтрами (табл.8). При выборе светофильтра необходимо знать области поглощения света веществом (его спектр).

Длина волны в максимуме пропускания, нм

Ширина полосы пропускания, нм

Как известно, ощущение цвета возникает в результате воздействия на зрительный нерв электромагнитного излучения с длинами волн 380-760 нм (т. н. видимая часть спектра). Суммарное действие электромагнитных излучений во всем указанном интервале вызывает ощущение белого цвета. При отсутствии в видимой части спектра определенного интервала длин волн возникнет ощущение цветности. Если вещество поглощает луч какого-либо цвета (назовем его спектральным), оно окрашивается в так называемый дополнительный цвет. Именно он возникает в зрительном аппарате, если из белого луча изымается спектральный цвет. Например, если вещество поглощает свет с длиной волны 590 нм (желтый), то оно окрашено в синий цвет (425 нм).

В соответствии с вышесказанным, цвет светофильтра должен являться дополнительным по отношению к окраске раствора (табл.9).

Соотношение окраски растворов и характеристики светофильтров

Поглощаемая длина волны, нм

Длина волны пропускаемого света, нм

Рис. 5. Оптическая схема ФЭК-56М. 1 – источник света; 2 – сменный светофильтр; 3 – призма; 4 – зеркала; 5 – кюветы с рас-творами ; 6 – раздвижные диафрагмы с измерительными барабанами; 7 – фотоэлементы; 8 – усилитель; 9 – микроамперметр. A NAME=» Порядок работы на приборе ФЭК-56М»>